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Après avoir obtenu son baccalauréat, Sophie Guillemin enchaîne divers emplois, tels que figurante à Euro Disney et serveuse dans un fast-food. En 1998, elle attire l'attention de Cédric Kahn, qui lui offre le rôle principal dans le film L'Ennui. Cette performance lui vaut une nomination aux César pour le meilleur espoir féminin. Elle a révélé qu'elle n'avait pas préparé son rôle et que Kahn souhaitait qu'elle adopte une attitude neutre, lui conseillant de se comporter comme une secrétaire lorsqu'elle en faisait trop.

En 2000, elle apparaît dans On fait comme on a dit et Harry, un ami qui vous veut du bien, où elle joue la compagne de Sergi Lopez, ce qui lui permet d'être à nouveau nominée pour un César. Elle poursuit sa carrière avec des comédies telles que Ça ira mieux demain et Du côté des filles. Dans A la folie, pas du tout, elle incarne la meilleure amie d'Audrey Tautou.