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Pauley Perrette a connu une enfance marquée par de fréquents déménagements en raison des changements de poste de son père. Malgré cela, elle réussit à obtenir un master en criminologie, tout en s'intéressant également à la sociologie et à la psychologie, avec un intérêt particulier pour la science médico-légale. Sa carrière artistique débute en 1994 à la télévision, où elle apparaît dans des séries telles que Frasier et Demain à la Une, avant de décrocher un rôle récurrent dans la deuxième saison de Murder One en 1996.

Après avoir multiplié les apparitions dans diverses productions comme Philly, Dawson et 24, Pauley Perrette obtient un rôle fixe en tant qu'experte informatique dans NCIS : Enquêtes spéciales à partir de 2003. Cette série lui permet de se faire connaître du grand public et d'affirmer sa place dans le milieu télévisuel.